沃森和克里克1953年在英國《Nature》雜志上發表的DNA雙螺旋結構，不但為人類認識生命的本質，揭示生命現象，打開了一扇大門，而且也為我們后來的臨床分子診斷奠定了基礎。臨床分子診斷系指采用分子生物學方法（基因擴增、測序、雜交、蛋白質組分析、代謝組學分析等）檢測患者體內特定遺傳物質的結構或表達水平的變化而做出的診斷。分子診斷的材料包括D N A、R N A、蛋白質和代謝途徑中涉及的小分子。分子診斷發展到現在，如果說有階段性里程碑的話，從1953年始，幾乎每隔10年左右即有。1963年，桑格的雙脫氧測序方法的發明，使特定基因的DNA序列不再神秘。美國的雅勞和伯森在研究人類激素時，發明了采用放射性核素標記的可測量微量激素的放射免疫試驗（Radioimmunoassay，RIA）。其后，在相當長一段時間內，放射性核素標記方法在分子生物學研究和分子診斷得到了廣泛應用。1972-1973年伯格等創建了重組DNA技術，由其衍生的基因工程，不但大大拓展了分子診斷技術，而且改變了人類的生活。1983年莫利斯發明的聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR），在其耐熱DNA聚合酶的瓶頸問題解決后，1989年后，即成為生命科學研究和分子診斷的“革命性”技術，并使得人類基因組計劃得以在1990年開始啟動。現在的涉及DNA和RNA的分子診斷，幾乎離不開PCR及其衍生技術。1991-1993年實時熒光PCR技術使PCR定量變得簡單明了，并大大減少了實驗室“污染”的機會。芯片技術的出現，解決了高通量檢測的問題。2003年人類基因組計劃的初步完成，進入到后基因組時代，功能基因組學研究揭示了人類各種基因多態性與疾病易感及藥物敏感的關系，并延伸到腫瘤基因組的研究，從基因結構變化及其表達，得到個體疾病的預后和治療藥物的選擇信息，進入到個體化醫學檢測時代。2010年代以后，隨著新一代測序技術的出現，個體基因組的分析變得迅捷而又價廉，是分子診斷領域的又一個革命性的進步。
臨床分子診斷尤其是涉及到基因擴增的檢測技術，要保證檢驗質量，必須有嚴格的實驗室質量管理，并標準化，否則，極易出現由實驗室擴增產物或標本之間交叉“污染”所致的假陽性結果，影響臨床疾病的診療。
一、我國的臨床分子診斷應用及質量管理的回顧
我國乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）人群感染率一直較高，上個世紀80年代，在國內不少傳染病醫院或醫院的傳染科實驗室，即采用同位素（P32）標記DNA探針直接膜上斑點雜交的方法檢測HBV DNA。但由于核酸斑點雜交的檢測敏感性較低（105拷貝/ml以上），盡管假陰性結果存在，但假陽性問題較少發生。1989年后，隨著PCR技術的引入，從90年代初到中期，全國大到三級甲等醫院，小到鎮一級的衛生院，眾多的實驗室都在開展臨床PCR檢驗，全國生產PCR試劑的廠家也有上百家之多。臨床檢測應用中出現了大量的假陽性問題，于是，有些臨床實驗室在檢測HBV DNA時，檢測后，通常是先看乙肝“兩對半”結果，相符即報陽性，不相符報陰性。一個性病病原體核酸PCR檢測，出現陽性結果，則將患者找過來問，有臨床癥狀的，報陽性，否則，報陰性。導致了臨床醫生對PCR檢驗結果的不信任。其影響之大之深，直到現在，在不同的學術場合，乃至一些臨床疾病診療指南內，一提到PCR，就會說其不可靠，假陽性過高。
鑒于上世紀90年代中期臨床PCR檢驗存在的上述問題，衛生部臨床檢驗中心于1998年3月20日在衛生部北京醫院召開專家座談會，與會專家指出了所存在的大量問題，隨后不到一個月，衛生部下發了《關于暫停臨床基因擴增（PCR）檢驗的通知》（衛醫發[1998]第9號），暫停了PCR在臨床檢驗中的應用。這種暫停并不意味著PCR技術本身有什么問題，無疑其是一個成熟的技術，問題的存在是因為應用的不規范，一則實驗室沒有嚴格的實驗室分區設計；二是實驗技術人員沒有經過臨床基因擴增檢驗相關的質量保證方面知識的培訓；三是實驗室沒有建立有效的質量保證體系；四是當時的試劑方法多為科研用擴增產物初步鑒定所用到的PCR凝膠電泳方法，很不規范。經過充分醞釀和準備，衛生部臨床檢驗中心（以下簡稱部中心）于1997年年底，向全國發出了第一次HBV DNA質評樣本進行室間質量評價的預研[1]，1998年正式開展HBV DNA和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）RNA室間質量評價項目[1,2]。1999年8月舉辦了第一期《全國臨床基因擴增檢驗實驗室技術人員培訓班》。2002年1月衛生部下發了《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛醫發〔2002〕10號），要求凡是開展向患者收費的臨床基因擴增檢驗項目的臨床實驗室必須按規范進行設置，要有嚴格的實驗室分區，配備必要的儀器設備，人員須接受部中心及其指定機構的培訓，持證上崗。同時，要建立實驗室質量保證體系，編寫標準操作程序（Standard operation procedure，SOP）。具備上述硬件和軟件后，須通過由部中心或省級臨床檢驗中心組織的專家驗收，合格后方可正式開展臨床基因擴增檢驗項目。同時，部中心下發了《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范》（衛檢字[2002]9號）。2002年7月深圳市人民醫院檢驗醫學部分子生物室成為第一家通過驗收的臨床基因擴增檢驗實驗室。同年，部中心組織編寫了人員培訓教材《臨床基因擴增檢驗技術》[3]，根據實際驗收發現的問題及技術的進展，2007年又出版了《實時熒光PCR技術》[4]。2010年12月衛生部正式下發了《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號）。截止到2011年10月，全國按照所制定的標準通過驗收的臨床基因擴增檢驗實驗室共1600余家。采用所編寫的培訓教材和培訓模式共舉辦了培訓班150多期，培訓實驗室技術人員13000多人，涉及全國28個省、直轄市和自治區。
為保證臨床基因擴增檢驗的準確性，實現病毒核酸定量檢測的量值溯源，部中心自2002年開始研制HBV和HCV核酸檢測國家標準物質[5-7]，分別于2005年和2007年獲得國家二級和一級標準物質證書。并采用基于MS2噬菌體衣殼蛋白包裝外源RNA的病毒樣顆粒，研制無生物傳染危險性且穩定的RNA病毒核酸質控品和標準物質[8-10]，獲得5種HCV RNA和1種HIV-1 RNA液體國家二級標準物質。
二、現狀及問題
長期以來，我國的臨床分子診斷項目主要在感染性疾病病原體核酸的擴增檢測，如HBV、HCV、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、結核分枝桿菌、沙眼衣原體、淋球菌等，所采用的方法基本上都是實時熒光PCR，開展的科室主要在醫療機構的檢驗科，個別在感染科、皮膚科等臨床科室的實驗室。極少部分在遺傳病的產前診斷，如廣東、廣西和海南地區的地中海貧血的產前基因檢測等，采用的方法主要有PCR瓊脂糖凝膠電泳和PCR雜交（膜上和芯片）等，開展的科室除了檢驗科外，相當部分在婦幼保健相關的產前診斷中心的實驗室。已接受培訓的人員及通過驗收的實驗室基本上也都是這些實驗室。上述實驗室相當一部分都經過了5-10年的運行及持續改進培訓（各級臨床檢驗中心定期舉辦的質控和持續改進培訓班及會議等），除了有符合分區要求的實驗室外，基本上都建立了較為完整的實驗室質量管理體系，有了較好的質量意識，迅速扭轉了臨床PCR檢驗不可靠的局面。盡管如此，上述實驗室仍有需要注意或改進之處，主要在以下幾個方面，主要是理念問題：
（1）SOP沒有可操作性。這一點是實驗室質量管理和標準化的靈魂，如果SOP的編寫不是為實際工作，只是為了應付驗收檢查，則質量管理和標準化就無從談起。
（2）儀器設備維護和校準不到位。對PCR儀、恒溫干浴儀、生物安全柜、測序儀、雜交儀、芯片掃描儀、加樣器等儀器設備沒有定期的維護，或根本不知道怎么維護。對加樣器、擴增儀等的校準由外部機構如儀器廠家、計量部門等進行，流于形式，沒有SOP、沒有校準的原始實驗記錄，并且不清楚儀器設備的技術檔案如何建立及其作用。
（3）實驗記錄的形式化及不會歸檔。
（4）不會分析室內質控結果，有些沒有商品質控品的項目不知道質控品從哪來，自然就沒有室內質控。
（5）有些項目不參加室間質量評價。
（6）人員的內部培訓形式化，不參加相關的質控會議，缺乏持續的外部培訓。此外，也有相當的人員對實驗室分區、緩沖間、傳遞窗和空氣流向設計的必要性和正確性的理解不到位。
隨著新的治療藥物、藥物代謝與特定基因多態性關系、藥物作用特定基因的突變等的研究進展，以個體化用藥治療為特征的個體化醫學正快步走向臨床醫學的前臺，個體化醫學能得以實施的一個關鍵性支柱就是以基因及結構變化和基因表達為檢測靶標的個體化分子檢測，這些檢測除了熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）和銀增強原位雜交 （Silver - enhanced in situ hybridization，SISH）檢測乳腺癌HER-2/neu基因擴增以及免疫組織化學法（Immunohistochemistry，IHC）檢測HER2受體蛋白表達狀態等少數項目外，基本上都涉及PCR擴增，如基于特異熒光探針的實時熒光PCR、擴增阻滯突變（amplification refractory mutation system，ARMS）實時熒光PCR、蝎形（Scorpion）探針ARMS實時熒光PCR、PCR測序、PCR芯片或膜或微顆粒（如luminex）上雜交等。相關研究的進展，帶來了“分子病理學”、“腫瘤基因組學”、“轉錄組學”和“藥物基因組學”等概念，最早接觸這些概念者是相關專業和臨床科室的一些專家，于是，近年來個體化醫學檢測在全國的許多醫療機構的病理科、藥劑科、腫瘤科、婦產科、內科、甚至胸外科的實驗室開展起來，混亂狀況與上世紀90年代初中期病原體核酸PCR檢測極為相似，其問題主要表現在以下幾個方面：
（1）沒有規范的實驗室分區設計。大多數開展此類檢測的實驗室目前處于這樣一個狀況。
（2）沒有任何的實驗室質量保證體系，不知道臨床基因擴增檢驗實驗室須驗收合格后，方能開展臨床檢驗項目。
（3）人員沒有經過有資質機構的規范化培訓，缺乏質量意識。
（4）開展臨床檢測，有的使用商品試劑盒，有的是自配試劑但沒有嚴格的試劑配制SOP，有的甚至一部分實驗如標本制備和基因擴增在自己實驗室完成，測序則像研究生做科研一樣，找有關商業測序公司進行。
（5）沒有室內質控，或根本不知道如何進行室內質控。
（6）除了極少部分實驗室參加了一些國外公司組織實驗室間結果比對外，基本上沒有定期的室間質量評價或實驗室間比對。
三、展望
一件事情能否成功，離不開“天時、地利、人和”三個要素，“人”放在后面，但人是最重要的。沒有高素質的實驗室技術人員，一是無法高質量的完成常規檢測操作，二是不可能樹立起真正的質量意識。這里的高素質主要指兩個方面，一是具備較好的專業知識技能，其次的也是最重要的，就是做事“認真”。有了高素質的技術人員，外部的上崗培訓，通俗地講就是一個“洗腦”過程，更多的是提供一種理念，即通過培訓，能明確知道在臨床基因擴增檢驗中，如果不注意把握好一些關鍵環節，采取一些有效的措施，所得到結果就有很大的可能性是錯的。但僅有外部的培訓遠遠不夠，在常規檢驗中，對實驗室內部發生的問題有針對性的培訓和自我完善，與最初的培訓的“被動學習”不同，其源于實踐高于實踐，是“主動思考”得來的東
西，會有質的飛躍。因此，作為臨床基因擴增檢驗實驗室應在人員具有外部培訓合格后，可通過講座、討論、咨詢、練習、自學等方式進行有效的內部培訓，培訓的記錄可以是書面考試、實驗考核結果、問題討論心得、問題解決的報告、針對日常工作的問題進行研究的論文和綜述等。
運動的物體，速度越快慣性越大。應該說，人類的思維很快，所以慣性也最大。從一個不好的習慣變成良好的習慣確實也很難，但良好的習慣一旦養成，即成為生產力。臨床實驗室從長期的經驗管理模式要進入到真正的質量管理，無疑是需要時間的，如果是一張白紙，則相對容易省時得多，關鍵是寫的第一筆不能出問題。臨床基因擴增檢驗實驗室有很多是新建的，自然實驗室技術人員可能也是新進人員，如果對其在一開始就樹立質量意識和理念，加上認真的態度和良好的專業素質，就很容易使實驗室進入到質量管理狀態。當然，如果一件事情你持續不斷地去加強它，它終究會成為一種習慣。
有了上面的兩個基石，余下的就是具體如何去做好的方法問題。做一件事情，沒有一個好的過程很難得到一個好的結果，至少是出現好的結果的概率極低。臨床基因擴增檢驗亦如此。對臨床基因擴增檢驗中的“過程”（包括分析前、中和后）的有效掌控，最關鍵的就是靠SOP的按實際工作詳細制訂和日常工作中的切實遵循。編寫有可操作性SOP的一個基本原則就是，怎么做怎么寫，注重最可能影響結果的細節。為使實驗室操作者能形象的理解和掌握SOP，可采用文字敘述加照片圖示的方法。此外，要指出的是，一個實驗室剛建立，由于沒有太長的實際檢驗運行時間，有很多的問題沒有想到，因此，編寫的SOP可能就會有缺陷，這就需要在以后實際工作中，不斷根據發生的問題，對文件進行修改，其根本目的是避免同樣的問題出現第二次，這也是質量管理的精髓。整個檢驗過程包括標本采集運送保存、儀器設備使用維護校準、室內質控及其分析、室間質評及其分析和結果報告與解釋等細節，決定于有可操作性的SOP，細節決定成敗。
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摘自定向點金《臨床實驗室》雜志2013年第十一期
